91/180/CEE: Decisione della Commissione, del 14 febbraio 1991, che stabilisce metodi di analisi e di prova relativi al latte crudo e al latte trattato termicamente.

(NORMA FIL/IDF 148A:1995  Metodo A):

VII. ENUMERAZIONE DELLE CELLULE SOMATICHE

Il presente procedimento descrive due metodi come metodi di riferimento per la numerazione delle cellule somatiche:

A. Il metodo microscopico (Fil IDF 148A:1995)

B. Il metodo fluoro-opto-elettronico.

A. Metodo Microscopico

1. Oggetto e campo di applicazione

Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento per la enumerazione delle cellule somatiche nel latte crudo.

Il presente procedimento descrive il metodo per la determinazione del numero di cellule nel campione di latte per tarare e verificare l’accuratezza del metodo fluoro-opto-elettronico (vedi B.1).

2. Definizione

Ai fini del presente metodo per cellule somatiche si intendono quelle cellule, quali leucociti e cellule epiteliali, i cui nuclei possono essere distintamente colorati con il blu di metilene.

3. Principio

0,01 ml di latte vengono distribuiti su un’area di 1 cm$ di vetrino. Il film viene quindi essiccato e colorato. Per il conteggio si usa un microscopio. Il numero di cellule contenute in 1 ml si ottiene moltiplicando il numero di cellule somatiche contate in un’area determinata per il fattore di lavoro.

4. Reattivi

Le sostanze usate devono essere di purezza analitica.

Soluzione colorante

Composizione

Blu di metilene

0,6 g

Etanolo – 99 %

54,6 ml

1,1,1-tricloroetano oppure tetracloroetano

40,6 ml

Acido acetico glaciale

6,6 ml

Avvertenza

Il tetracloroetano è velenoso. Nel caso venga usato, la preparazione del colorante e l’applicazione sul vetrino devono essere effettuate sotto cappa.

Preparazione

Mescolare l’etanolo con l’1,1,1,-tricloroetano o il tetracloroetano in una bottiglia e riscaldare a bagnomaria a 60-70 gC. Addizionare il blu di metilene, mescolare accuratamente, raffreddare in frigorifero a 4 gC per 12-24 ore ed aggiungere acido acetico glaciale. Filtrare su filtro con diametro dei pori non superiore ai 10-12 micron e conservare la soluzione colorante in una bottiglia a tenuta d’aria. Se si sono formati granelli o sedimenti, prima dell’uso filtrare nuovamente.

5. Apparecchiatura e vetreria

5.1. Microscopio con ingrandimento di 500-1 000.

5.2. Microsiringa 0,01 ml con precisione non inferiore a p 2 %.

5.3. Vetrino con campo delimitato di 20 mm × 5 mm per il film, oppure un vetrino standard ed una sagoma di 20 mm × 5 mm delimitante il campo per il film.

5.4. Piastra riscaldante livellata (30-50 gC) per essiccare i vetrini.

5.5. Phon (asciugacapelli) per asciugare il film.

5.6. Bagnomaria, termostatabile a 30-40 gC per riscaldare il campione di latte.

5.7. Vetrino micrometrico di riferimento, con intervalli di 0,01 mm.

6. Procedimento

6.1. Campione di latte

Il campione di latte deve essere analizzato entro 6 ore dal campionamento. La temperatura di conservazione non deve superare i 6 gC. Occorre evitare il congelamento.

6.2. Preparazione del campione nel laboratorio

Riscaldare il campione in bagnomaria (5.6) a 30-40 gC. Mescolare quindi con cura. Raffreddare alla temperatura alla quale è stata tarata la microsiringa (5.2), ad esempio 20 gC.

6.3. Pre-trattamento dei vetrini

Pulire i vetrini (5.3), ad esempio con etanolo, asciugare con carta che non lasci particelle, esporre alla fiamma e raffreddare. Conservare in una scatola per evitare la polvere.

6.4. Preparazione del film

Prelevare con una microsiringa (5.2) 0,01 ml di latte dal campione preparato come descritto. Pulire accuratamente la parte esterna della siringa che viene a contatto con il latte. Portare la siringa sul vetrino (5.3) seguendo dapprima il contorno del rettangolo (20 mm × 5 mm) e ricoprendo quindi tutta la superficie il più uniformemente possibile. Porre il vetrino su una piastra riscaldante livellata (5.4) fino a essiccazione completa.

Per ciascun campione di latte devono essere preparati ed analizzati almeno due film.

6.5. Colorazione dei film

Immergere nella soluzione colorante (4) per 10 minuti. Essiccare, completando eventualmente con il phon (5.5). Immergere i film in acqua di rubinetto fino ad asportare tutto il colore in eccesso. Essiccare quindi nuovamente e conservare al riparo dalla polvere.

6.6. Taratura del campo microscopico

Sulla base dell’ingrandimento scelto (× 500 – × 1 000) determinare il diametro del campo microscopico con il vetrino micrometrico di riferimento (5.7).

7. Conteggio e calcolo

7.1. Conta delle cellule

Con il microscopio (5.1). Contare anziché le cellule soltanto i loro nuclei. Questi sono chiaramente riconoscibili e per la conta almeno la metà del nucleo deve essere visibile nel campo microscopico. Contare le strisce o i campi nel terzo centrale del film, evitando di prendere in considerazione quelli che ricadono esclusivamente nelle zone periferiche del film. L’accuratezza con cui sono stati preparati i film e quindi l’attendibilità dei risultati, deve essere controllata almeno una volta al mese eseguendo la conta in varie parti del film. Il conteggio può essere anche effettuato contando i campi microscopici ripartiti in modo tale che tutte le parti del film siano ugualmente rappresentate.

7.2. Numero minimo di cellule da contare

Poiché la conta delle cellule somatiche al microscopio può essere anche usata per la standardizzazione dei procedimenti di conteggio automatico e meccanizzato, il coefficiente di variazione delle conte su campioni identici non deve risultare più elevato di quello ottenuto con strumenti elettronici. Il coefficiente di variazione per un campione di latte contenente 400 000-600 000 cellule/ml non deve superare il 5 %.

Per ottenere questo valore di ripetibilità il numero di cellule somatiche da contare per ciascun campione deve essere, in base alle caratteristiche della distribuzione di Poisson, di almeno 400.

La distribuzione di Poisson presuppone

M = V = s$,

dove

M è il valore medio,

V

è la varianza

e

s

è la deviazione standard.

Il coefficiente di variazione è:

CV = s × 100 % oppure CV = 100 % oppure CV = 100 %

CV =

s × 100 %

M

oppure CV =

100 %

s

oppure CV =

100 %

wM-

dove M (media) indica il numero di particelle (cellule) che sono state contate (cioè 400 per CV = 5 %).

7.3. Calcolo del fattore di lavoro

Nel caso di 0,01 ml di latte il fattore di lavoro è calcolato secondo 7.3.1 o 7.3.2.

7.3.1 Conteggio delle strisce tracciate trasversalmente al film

La lunghezza di ciascuna striscia su cui effettuare la conta è di 5 mm mentre la larghezza corrisponde al diametro del campo microscopico delimitato dal vetrino micrometrico di riferimento (5.7).

Fattore di lavoro = 20× 100

Fattore di lavoro =

20 × 100

d × b

dove

d = è il diametro del campo microscopico in mm, delimitato dal vetrino micrometrico di riferimento (5.7),

b

= è il numero di strisce su cui la conta è stata effettuata per intero.

7.3.2. Effettuando la conta dei campi microscopici nel terzo centrale del film oppure mediante la griglia

Fattore di lavoro: 20 × 5 × 100 = 12 732

Fattore di lavoro:

20 × 5 × 100

P × d² × s

4

=

12 732

d² × s

dove

d = è il diametro del campo microscopico in mm delimitato dal vetrino micrometrico di riferimento (5.7),

s

= è il numero di campi in cui è stata effettuata la conta.

7.4. Calcolo del tenore in cellule

Si moltiplica il numero di cellule somatiche contate (7.1 e 7.2) per il fattore di lavoro (7.3), ottenendo il numero di cellule per ml di latte.

7.5. Precisione

Il coefficiente di variazione (vedi 7.2) non deve essere superiore al 5 %.

Per la precisione non sono disponibili risultati di prove interlaboratorio accettate a livello internazionale

Per la convalida della determinazione della carica microbica, quali sono gli agenti inattivanti da usare?

Risposta:

La Farmacopea Armonizzata, al paragrafo 2.6.13, precisa che se il prodotto in esame possiede attività anti-microbica, questa deve essere, se possibile, rimossa o neutralizzata come descritto al Capitolo 2.6.12.

Se sono utilizzati dei tensioattivi per la preparazione del campione, si deve dimostrare la non tossicità verso i microrganismi e la compatibilità con eventuali inattivanti usati, come descritto in 2.6.12.

AGENTI INATTIVANTI

€ 75,02.

www.fil-idf.org

La funzione di Assicurazione di Qualità è offerta da una terza parte indipendente ed i laboratori aderiscono al programma di  “Proficiency Test” con un abbonamento.

Tutti i laboratori partecipanti ricevono, analizzano ed esaminano il materiale “challenge” per la presenza o assenza di microrganismi target oppure per il conteggio di microrganismi target.

Tutti i risultati sono elaborati ed il valore è stabilito in base ai risultati di tutti i laboratori partecipanti, indipendentemente dai metodi specifici utilizzati.

-“Proficiency Test Interno”

Questa funzione di Assicurazione di Qualità è nella maggioranza dei casi una funzione che il singolo laboratorio si è imposta.  Un laboratorio del gruppo sceglie il materiale “challenge” e chiede agli altri laboratori del gruppo di analizzare il materiale ricevuto per la presenza o assenza dei microrganismi target o per il conteggio dei microrganismi target. 

Tutti i risultati sono elaborati ed il valore è stabilito in base ai risultati di tutti i laboratori partecipanti, indipendentemente dai metodi specifici utilizzati.

-Glossario

Recupero Minimo Accettabile, valore medio, UFC, challenge test, microrganismi “challenge”, terreno agarizzato non selettivo, recupero percentuale, “pour plate” (tecnica per inclusione), coltura autentica di riferimento, coltura stock di riferimento, terreno agarizzato selettivo, “spread plate” (tecnica per striscio), coltura stock di lavoro.

-Introduzione

Ogni singola preparazione di terreno selettivo approntata in laboratorio, terreni commerciali pronti all’uso in piastra e basati sulla selettività devono essere sottoposti al controllo di qualità.

Oltre alle specificazioni di sterilità, pH, reazioni differenziali positive e negative e morfologia delle colonie si devono determinare e documentare anche la selettività ed il recupero.

-Dati di fatto

□ I terreni selettivi raramente dimostrano il recupero del 100% di UFC in confronto ad un identico challenge di microrganismi su terreno non selettivo.

□ Si devono pertanto determinare i limiti di Recupero Minimo Accettabile per ogni singolo terreno selettivo utilizzato in ogni singolo laboratorio.

-Recupero dei microrganismi “challenge” su terreno selettivo

La semplice procedura qui riportata  può essere utilizzata per dimostrare il recupero del microrganismi “challenge” su terreno selettivo.

(1) Selezionare la coltura stock di riferimento o la coltura stock di lavoro, rintracciabile rispetto ad una coltura autentica di riferimento, che sia appropriata rispetto alla caratteristiche del terreno selettivo usato per il challenge test.

(2) Preparare le diluzioni del microrganismo challenge per ottenere una concentrazione di 100 UFC.

Se si utilizza un terreno selettivo agarizzato con la tecnica  per inclusione (“poured plate”), si raccomandano 100 UFC per 1,0 mL.

Se si utilizza un terreno selettivo agarizzato, con la tecnica di striscio (“streak or spread plate”), si raccomandano 100 UFC per 0,1 mL.

(3) Inoculare 3 terreni agarizzati selettivi con 100 CFU “microrganismi challenge” per 1,0 mL o 0,1 mL.

Inoculare 3 terreni agarizzati non-selettivi (standard methods) con 100 UFC “microrganismi challenge”  per 1,0 mL or 0,1 mL.

(4) Incubare entrambi le serie di terreni  selettivi e non-selettivi secondo quanto indicato dalle specifiche  del  terreno selettivo.

(5) Ultimata la incubazione, contare e fare la media delle UFC sia per il terreno selettivo che non selettivo. 

Calcolare le medie e dividere il valore medio delle UFC del terreno non selettivo per le UFC del terreno selettivo. Moltiplicare il valore ottenuto per 100 per determinare il Recupero Percentuale.  

NOTA

Ulteriori notizie possono essere trovate nel Technical Manual 33.1. Edition della Microbiologics.

www.microbiologics.com

Lo strumento deve essere inviato al “laboratorio di taratura”.

Ogni singolo strumento deve essere spedito completo di un documento di identificazione dove sono riportate tutte le informazioni relative alla sua identificazione, ultima taratura, spiegazione di eventuali anomalie di funzionamento.

Dovrà essere indicato anche il nome dell’operatore e / o persona responsabile dell’assistenza tecnica locale.

Si riporta qui di seguito il documento da compilare e che dovrà accompagnare il campionatore inviato al “laboratorio di taratura”.

▪ Effettuare tale operazione in condizioni di sterilità (in Cabina di Sicurezza Biologica)  indossando camice e guanti.

▪ Rispettare i volumi di riempimento indicati dal produttore delle piastre (15-18 ml). Non si devono formare bolle in superficie.

▪ Non chiudere le piastre a contatto appena riempite, quando il terreno è ancora caldo. Lasciare solidificare e raffreddare il terreno sotto il flusso laminare sterile per circa 30 minuti per evitare la formazione di fastidiose condense.

▪ Una volta raffreddatosi il terreno, chiudere le piastre con i rispettivi coperchi, impilarle capovolte in appositi contenitori rigidi, diversi a seconda della finalità di impiego e del tipo di terreno, per evitarne il rovesciamento e l’apertura durante la manipolazione ed il trasporto.

▪ Identificare i contenitori delle piastre con apposita etichetta sulla quale riportare la data di produzione ed il nome del terreno.

▪ Se non utilizzate immediatamente, stoccare le piastre a 4°C.

▪ Prima dell’utilizzo delle piastre, trasportarne alcune, scelte a campione, in Cabina a flusso laminare e testare la sterilità.

▪ Procedere alla identificazione  inequivocabile e leggibile delle piastre, con pennarello indelebile od etichetta con il seguente codice identificativo:

(a) sigla del terreno di coltura

(b) numero corrispondente al quello con cui è stato denominato il punto di prelievo per il quale la piastra a contatto verrà utilizzata

(c) i replicati verranno indicati dalle lettere (a), (b), (c).

(d) per diversificare le piastre da utilizzare per la valutazione della carica psicrofila, rispetto a quelle per la carica mesofila, far seguire il numero dalla sigla -22°C

(e) per diversificare le piastre a contatto da utilizzare per i campionamenti di superficie da quelle per il campionatore d’aria, apporre con la punta piatta di un pennarello nero, lungo i due lati opposti di esse, due linee parallele.

“Il controllo microbiologico delle mani consente la verifica dell’adozione di corrette procedure igieniche da parte del personale, per la prevenzione del rischio di contaminazione.

Inoltre la effettuazione di campionamenti prima e dopo il corretto lavaggio delle mani rappresenta un utile strumento formativo per coinvolgere il personale sull’importanza dell’applicazione delle procedure stesse nei luoghi di lavoro.

Si utilizzano alla scopo piastre a contatto  riempite con terreni nutritivi adatti alla ricerca dei parametri desiderati (ad esempio carica batterica totale e fungina).

Le piastre devono essere posizionate su un piano stabile, pulito, evitando contaminazioni esterne durante il sollevamento e la chiusura del coperchio, con il fondo centimetrato orientato correttamente (lettere in verticale e numeri in alto).

Si fanno adagiare e premere delicatamente sul terreno agarizzato, per 10 secondi, i polpastrelli di una mano del lavoratore.

I risultati sono espressi in termini di UFC/5 polpastrelli.

Indice della Guida

▪ Idoneità del campione

▪ Modalità di campionamento e consegna

- Diagnostica veterinaria

- Patologie da tossici

- Controlli alimenti ad uso umano e ad uso animale

- Controlli residui, sostanze anabolizzanti e contaminanti ambientali

- Controlli scambi intracomunitari

- Controlli scambi extracomunitari

- Presidi immunizzanti (vaccini).

EN 15850 for determination of zearalenone in maize is based on High Performance Liquid Chromatography with immune-affinity column cleanup and fluorescence detection.

EN 15851 for determination of Aflatoxin B1 is based on High Performance Liquid Chromatography.

http://ec.europa.eu/dgs/jrc/index.cfm