Javeed Kakroo

Culture is a technique where we grow microorganisms in a nutritional liquid or on a solid medium in order to increase numbers and simplify identification. It is also important as a first step in several laboratory techniques and for testing of antimicrobial sensitivity.

There are many types of medium available for culturing microorganisms, and so it is important to know which is best to use – especially for organisms that are difficult to grow.

Many of these media are available commercially, but for some it can be more cost effective to prepare the media yourself. For completeness, recipes for all media above are listed in alphabetical order. Adjustment of these recipes may be necessary for some cultures, but these will provide a good starting point. Most of the recipes include ‘agar’, which can be left out to make liquid cultures, but some rely on the use of nutrient agars which will require replacing with another nutrient source to make a liquid medium for culture.

Contents:

Bacteroides bile-esculin (with gentamicin and bile) agar
Bordet-Gengou agar with methicillin or cephalexin
Buffered Charcoal Yeast Extract agar
Campylobacter-selective agar
Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin agar
Cystine Heart agar
Cystine-Tellurite Blood agar
Fletcher’s medium with rabbit serum
Gram-Negative Enrichment Broth
Hektoen agar
Horse Blood-Charcoal agar
Kanamycin-Vancomycin Laked Blood agar
Leptospira Medium with Bovine Serum Albumin (BSA)-Tween 80
Löffler’s Coagulated Serum Medium
MacConkey agar
MacConkey-Sorbitol agar
Modified Thayer-Martin agar
New York City agar
Pseudomonas cepacia agar
Regan-Lowe Cephalixin agar
Salmonella–Shigella agar
Selenite Enrichment Broth
Stuart Medium with rabbit serum
Thiosulfate-Citrate-Bile Salts-Sucrose agar
Tinsdale agar
Xylose-Lysine-Deoxycholate agar

Bacteroides bile-esculin with gentamycin and bile

Bacteroides bile-esculin (with gentamicin and bile) agar:

45g/l Tryptic Soy Agar
20g/l Ox bile
1 g/l Esculin
5g/l Ferric Ammonium Citrate
12mg/l Hemin
100mg/l Gentamicin

Bordet-Gengou agar with methicillin or cephalexin:

15g/l Agar
5g/l Potato Infusion
5g/l Sodium Chloride
3g/l Meat Peptone
2g/l Casein Peptone
10ml/l Glycerol
15% Sheep’s blood
Methicillin or Cephalexin as appropriate to your sample

Buffered Charcoal Yeast Extract Agar

Buffered Charcoal Yeast Extract agar:

17g/l Agar
5g/l Yeast Extract
10g/l ACES Buffer
3g/l Activated Charcoal
5g/l Potassium Hydroxide
1g/l alpha-Ketoglutarate
4g/l L-Cysteine
25g/l Ferric Pyrophosphate

Campylobacter-selective agar (for example):

5g/l Agar
12g/l Pancreatic Digest of Casein
5g/l Peptic Digest of Animal Tissue
5g/l Sodium Chloride
4g/l Activated Charcoal
3g/ Yeast Extract
3g/l Beef Extract
1 g/l Corn Starch
1g/l Cycloheximide
32mg/l Hemin
32mg/l Cefoperazone
20mg/l Vancomycin

Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin agar

Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin agar:

20g/l Mannitol
17g/l Peptone
5g/l Agar
3g/l Proteose Peptone
2g/l Yeast Extract
2g/l Sodium Pyruvate
1g/l Sodium Chloride
5g/l Sodium Deoxycholate
5g/l Sodium Cholate
30mg/l Neutral Red
10mg/l Magnesium Sulfate
4mg/l Irgasan®
4mg/l Cefsulodin
5mg/l Novobiocin
1mg/l Crystal Violet

Cystine Heart agar:

15g/l Agar
10g/l Beef Heart (Infusion from 500g)
10g/l Proteose Peptone
10g/l Dextrose
5g/l Sodium Chloride
1g/l L-Cystine

Cystine-Tellurite Blood agar

Cystine-Tellurite Blood agar:

15g/l Agar
13g/l Casein Peptone
5g/l Sodium Chloride
5g/l Yeast Extract
2g/l Beef Heart (Infusion from 500g)
44mg/l L-Cystine
50ml/l 1% Potassium Tellurite
5% Sheep’s Blood

Fletcher’s medium with rabbit serum:

5g/l Agar
5g/l Sodium Chloride
3g/l Peptone
2g/l Beef Extract
80ml/l Rabbit Serum

Gram-Negative Enrichment Broth:

10g/l Pancreatic Digest of Casein
10g/l Peptic Digest of Animal Tissue
5g/l Sodium Chloride
5g/l Sodium Citrate
4g/l Dipotassium Phosphate
2g/l Mannitol
5g/l Monopotassium Phosphate
1g/l Dextrose
5g/l Sodium Deoxycholate

Hektoen agar

Hektoen agar:

5g/l Agar
12g/l Peptic Digest of Animal Tissue
12g/l Lactose
12g/l Sucrose
9g/l Bile Salts
5g/l Sodium Chloride
5g/l Sodium Thiosulfate
3g/l Yeast Extract
2g/l Salicin
5g/l Ferric Ammonium Citrate
1g/l Acid Fuchsin
64mg/l Bromothymol Blue

Horse Blood-Charcoal agar:

12g/l Agar
10g/l Beef Extract
10g/l Casein/Meat polypeptone
10g/l Starch
5g/l Sodium Chloride
4g/l Charcoal
1mg/l Nicotinic acid
10% Horse Blood

Kanamycin-Vancomycin Laked Blood agar:

20g/l Peptamin
17g/l Agar
5g/l Sodium Chloride
2g/l Yeast Extract
1g/l Dextrose
1g/l Sodium Bisulfite
5mg/l Hemin
1mg/l Vitamin K
40ml/l Vancomycin
40ml/l Kanamycin
50ml Laked Sheep’s Blood

Leptospira Medium with Bovine Serum Albumin (BSA)-Tween 80:

Base medium (900ml)11g/l Agar

1g/l Disodium Phosphate
1g/l Sodium Chloride
3g/l Monopotassium Phosphate
1ml/l 10% Glycerol
1ml/l 25% Ammonium Chloride solution
1ml/l 10% Sodium Pyruvate solution
1ml/l 0.5% Thiamine solution

Albumin Supplement (100ml)Magnesium Chloride-Calcium Chloride solution:100g/l BSA

125ml/l 10% Tween-80 solution
100ml/l 0.5% Iron Sulfate solution
10ml/l Magnesium Chloride-Calcium Chloride solution (see below)
10ml/l 0.02% Cyanocobalamin solution
10ml/l 0.4% Zinc Sulfate solution

Magnesium Chloride-Calcium Chloride solution:

15g/l Calcium Chloride Dihydrate
15g/l Magnesium Chloride Hexahydrate

Loeffler’s Coagulated Serum Medium

Löffler’s (also spelled ‘Loeffler’) Coagulated Serum Medium:

5g/l Dextrose
5g/l Gelatin Peptone
5g/l Beef Extract
25g/l Sodium Chloride
750ml/l Bovine Serum

MacConkey agar

MacConkey agar:

17g/l Peptone
5g/l Agar
10g/l Lactose
5g/l Sodium Chloride
5g/l Bile Salts
30mg/l Neutral Red
1mg/l Crystal Violet

MacConkey-Sorbitol agar:

As above, but including 10g/l sorbitol instead of lactose

Modified Thayer-Martin agar:

23g/l Peptic Digest of Animal Tissue
20g/l Agar
5g/l Sodium Chloride
5g/l Dextrose
1g/l Starch
200ml/l Lysed Blood
5mg/l Colistin Methane Sulphate
3mg/l Vancomycin

New York City agar:

• 20g/l Agar
• 15g/l Proteose Peptone
• 5g/l Glucose
• 5g/l Sodium Chloride
• 4g/l Dipotassium Hydrogen Phosphate
• 1g/l Corn Starch
• 1g/l Potassium Dihydrogen Phosphate
• 100ml/l Horse Blood Cells
• 60ml/l Horse Plasma
• Yeast Autolysate Supplement (Available commercially, recipe below)

10g/l Yeast Autolysate fractions
1g/l Glucose
15g/l Sodium Bicarbonate

• NYC Supplement, also known as C.L.A.T. antibiotics (available commercially, recipe below)

5mg/l Colustin Methane Sulphonate

4mg/l Linomycin

1mg/l Amphotericin B

5mg/l Trimethoprim Lactate

Pseudomonas cepacia agar:

15g/l Agar
5g/l Sodium Pyruvate
3g/l Dipotassium Phosphate
1g/l Monopotassium Phosphate
5g/l Bile Extract
1g/l Enzymatic Digest of Animal Tissue
1g/l Ammonium Sulfate
2g/l Magnesium Sulfate
1g/l Ticarcillin
20mg/l Phenol Red
10mg/l Ferrous Ammonium Sulphate
1mg/l Crystal Violet
300 000Units Polymyxin B

Regan-Lowe Cephalixin agar:

• As Horse Blood-Charcoal Agar with the inclusion of 40mg/l Cephalexin

Salmonella–Shigella agar

Salmonella–Shigella agar:

5g/l Agar
10g/l Lactose
5g/l Bile Salts
5g/l Sodium Citrate
5g/l Sodium Thiosulfate
5g/l Beef Extract
5g/l Enzymatic Digest of Casein
5g/l Enzymatic Digest of Animal Tissue
1g/l Ferric Citrate
25mg/l Neutral Red
33mg/l Brilliant Green

Selenite Enrichment Broth:

10g/l Sodium Phosphate
5g/l Pancreatic Digest of Casein
4g/l Lactose
4g/l Sodium Selenite

Stuart Medium with rabbit serum:

10g/l Sodium Glycerophosphate
3g/l Agar
1g/l Sodium Thioglycollate
1g/l Calcium Chloride
2mg/l Methylene Blue
80ml/l Rabbit Serum

Thiosulfate-Citrate-Bile salts-Sucrose agar

Thiosulfate-Citrate-Bile Salts-Sucrose agar:

20g/l Sucrose
15g/l Agar
10g/l Dipeptone
10g/l Sodium Citrate
10g/l Sodium Thiosulfate
10g/l Sodium Chloride
5g/l Yeast Extract
5g/l Ox Bile
3g/l Sodium Cholate
1g/l Ferric Citrate
40mg/l Bromothymol Blue
40mg/l Thymol Blue

Tinsdale agar:

20g/l Protease Peptone
15g/l Agar
5g/l Yeast Extract
5g/l Sodium Chloride
425g/l Sodium Thiosulfate
3445g/l Potassium Tellurite
24g/l L-Cystine
100ml Serum

Xylose-Lysine-Deoxycholate agar

Xylose-Lysine-Deoxycholate agar:

5g/l Agar
5g/l Lactose
5g/l Sucrose
8g/l Sodium Thiosulfate
5g/l L-Lysine HCl
5g/l Sodium Chloride
3g/l Yeast Extract
1g/l Sodium Deoxycholate
8g/l Ferric Ammonium Citrate
80mg/l Phenol Red

Robert Millar (University of Warwick)

Society for Applied Microbiology

Il PAP Test è l’esame microscopico di cellule prelevate dal collo dell’utero.

Esso serve ad individuare lesioni precancerose del collo dell’utero.

Si svolge nel modo seguente:

Il prelievo viene effettuato dal ginecologo o dall’ostetrica introducendo nel canale cervicale  prima una spatola e poi una spazzolina, in modo da prelevare sia le cellule dell’esocollo (porzione esterna della cervice) che dell’endocollo (parte interna, detta canale endocervicale). Le cellule prelevate vengono strisciate su un vetrino e fissate (PAP test convenzionale),od inserite in un liquido conservante (PAP test su base liquida). Dopo questa operazione, il materiale prelevato viene inviato al laboratorio di citologia, dove viene colorato e letto al microscopio da una citologa o da un citologo professionisti. A seconda del tipo di cellule presenti sul vetrino, potranno essere date le seguenti risposte :

- Negativo  (90-95% dei casi): non vi sono cellule anormali

- Inadeguato (1-3%) : il prelievo non contiene un numero sufficiente di cellule, o le stesse non sono leggibili al microscopio per cause tecniche. Va ripetuto il prelievo.

- ASCUS (atypical squamous cells of undetermined significance,1-2%) : vi sono cellule atipiche di significato incerto. E’ necessario un approfondimento diagnostico.

- LSIL (low grade lesion,1-2%) : lesione di basso grado. Necessita di un approfondimento diagnostico, anche se nella maggior parte dei casi regredisce spontaneamente senza destare preoccupazione.

- HSIL (high grade lesion,< 1%) : lesione di alto grado. Va seguita con una colposcopia, esame diretto della cervice uterina da parte del ginecologo che si avvale di uno strumento particolare, il colposcopio. Se la colposcopia conferma la presenza di una lesione di alto grado, vengono  eseguiti una biopsia ed un successivo esame istologico, in base al quale verrà deciso il trattamento da eseguire.

La prevenzione

E’ possibile prevenire il cancro del collo dell’utero. E’ un tumore prevenibile al 100% se si esegue un PAP test in una struttura specializzata perlomeno ogni tre anni a partire dai 20-25 anni di età fino a 64. Le possibilità di prevenzione sono ulteriormente aumentate da quando è stata scoperta la causa indispensabile per l’insorgenza del cervico-carcinoma, vale a dire l’infezione da HPV (virus del Papilloma umano).Questa scoperta ha consentito la messa a punto di test di screening ancora più precisi basati sulla ricerca del virus HPV e di vaccini volti ad immunizzare le donne in età adolescenziale.

Per la convalida della determinazione della carica microbica, quali sono gli agenti inattivanti da usare?

Risposta:

La Farmacopea Armonizzata, al paragrafo 2.6.13, precisa che se il prodotto in esame possiede attività anti-microbica, questa deve essere, se possibile, rimossa o neutralizzata come descritto al Capitolo 2.6.12.

Se sono utilizzati dei tensioattivi per la preparazione del campione, si deve dimostrare la non tossicità verso i microrganismi e la compatibilità con eventuali inattivanti usati, come descritto in 2.6.12.

AGENTI INATTIVANTI

-Introduzione

I virus sono organismi parassitari obbligati, di dimensioni molto piccole (di dimensioni inferiori ai batteri, cioè inferiori a 100 nanometri), che si trovano nell’ambiente, in grado di infettare una gran varietà di organismi viventi. Sono parassiti intracellulari ed infettano la cellula ospite. A differenza di batteri e miceti, non sono in grado di moltiplicarsi al di fuori di una cellula ospite. Nella cellula ospite aumentano di numero, ne provocano la lisi cellulare con la conseguente emissione di un gran numero di particelle virali in grado di infettare altre cellule.

-La scoperta dei virus

Fu Martinus Beijerinck che nel lontano 1898 scoprì i virus studiando il “mosaico del tabacco”.

-Cosa i virus possono infettare 

I virus sono specifici per l’ospite che infettano. I batteri hanno specifici virus dai quali subiscono l’infezione: sono chiamati batteriofagi e causano gravi problemi nell’industria casearia per i prodotti fermentati ed i formaggi. Se le colture starter sono infettate, non sono in grado svilupparsi e la produzione del formaggio non può avvenire regolarmente.

-I batteriofagi utili

I fagi sono anche utilizzati in modo positivo per identificare in modo rapido batteri come la salmonella oppure per eliminare batteri patogeni come la listeria.

-I virus nel settore agricolo , animale ed umano

I virus che attaccano i vegetali causano danni ingenti ogni anno nel mondo intero con grandi perdite dei raccolti agricoli.

Nell’uomo, oltre ai “tradizionali” raffreddori ed influenza, causano il vaiolo e la rabbia.

-I virus e gli alimenti

Il virus non si può moltiplicare in un alimento, ma viene veicolato nell’alimento e provocare infezione quando l’alimento viene ingerito. La contaminazione può avvenire tramite l’acqua o per contatto diretto tra esseri umani, in particolare se l’operatore alimentare è contaminato e “distribuisce” i virus oralmente o fecalmente.

I principali virus associati ad infezioni di origine alimentare sono il rotavirus, l’epatite ed il norovirus.

-Rotavirus

Il rotavirus è stato identificato per la prima volta nel 1973 e causa diarrea nei bambini. E’ stato stimato che ogni bambino nel mondo al di sotto dei 5 anni è stato infettato dal rotavirus almeno una volta. Il virus si trasmette per via orale e fecale. Le feci di una persona infetta possono contenere sino a 10 trilioni di particelle virali per grammo (10-100 di queste particelle sono sufficienti per trasmettere l’infezione ad un’altra persona). Si ritiene che questo virus sia in grado di sopravvivere nell’ambiente per lunghi periodi al di fuori dell’ospite.

Il virus si trasmette a seguito di cattive condizioni igieniche su superfici ed in alimenti con passaggio nella bocca dei bambini. Con condizioni igieniche adeguate, questo virus può essere tenuto sotto controllo.

-Epatite

L’Epatite A è uno dei 5 tipi di virus (Epatite A, B, C, D, e E) che attaccano principalmente il fegato e causano la malattia.

Per quanto riguarda le malattie di origine alimentare, è solo l’Epatite A che è legata agli alimenti. Il virus dell’Epatite A entra dal cavo orale, si moltiplica nel corpo e quindi passa nelle feci. La sua diffusione è legata ad un non corretto (o mancato) lavaggio delle mani e si può diffondere per contatto diretto o consumando alimenti o bevande che sono state manipolate da una persona contaminata o infetta. Acqua contaminata o pesce crudo sono altre fonti di contaminazione.

Se il virus ha contaminato una superficie, si stima che rimanga infettivo per altri 30 giorni.

Quando una persona si infetta, i sintomi appaiono con un considerevole ritardo, anche di due settimane. Ciò è un grosso problema perché un operatore alimentare, durante questo periodo, può continuare la sua attività a preparare e manipolare alimenti, infettando molte altre persone, senza saperlo.

Alimenti che sono stati coinvolti con l’Epatite A sono carne cotta in sandwiches, frutta e succhi, latte e prodotti lattiero – caseari, vegetali, insalate, mitili e frutti di mare non cotti correttamente,

bevande con ghiaccio da acqua contaminata.

La prevenzione della contaminazione può avvenire adottando corrette pratiche igieniche e cuocendo gli alimenti a 90°C per 90 secondi (secondo quanto suggerito dall’ UK ACMSF –Advisory Committee on the Microbiological Safety of Foods -1998).

-Norovirus

Forse il più importante virus che provoca malattie di origine alimentare è il norovirus. Il suo nome deriva dalla città USA Norwalk nell’ Ohio dove nel 1968 si verificò una contaminazione in una scuola elementare. Questo virus è stato anche denominato SRSV (Small Round Structure Virus).

Appartiene alla famiglia delle Caliciviridae.

La malattia che produce viene indicata con diversi nomi quali vomito invernale, gastroenterite virale, gastroenterite acuta non batterica e influenza dello stomaco.

Le vie di trasmissione del norovirus sono principalmente due:

▪ la via oro-fecale mediante ingestione di alimenti od acqua contaminati da feci;

▪ diffusione per contatto diretto da persona a persona; l’aerosol che si sviluppa dal vomito di una persona infetta può contaminare una persona sana nelle sue vicinanze.

Non è stato dimostrato che il virus si possa trasmettere attraverso le vie respiratorie. La dose infettante sufficiente è di 10 particelle virali!

Il periodo di incubazione è di 24-48 ore, ma si sono avuti casi anche di sole 12 ore. I tipici sintomi della malattia sono vomito molto acuto e diarrea per 24-72 ore che si arrestano poi senza problemi.

Si ritiene che il 50% delle gastroenteriti alimentari siano da addebitare al norovirus.

La prevenzione della contaminazione può avvenire adottando corrette pratiche igieniche e cuocendo gli alimenti a 90°C per 5 minuti.

-Metodi analitici di identificazione dei virus

E’ stata messa a punto una metodica osservando le particelle virali sotto il microscopio elettronico per evidenziare la loro infettività o non infettività, ma ciò può avvenire solo in laboratori specializzati.

Un altro metodo è la PCR che riesce ad evidenziare le particelle virali senza però distinguere se sono o non sono infettive.

General information on pathogens is the subject of Pathogens:

www.abpischools.org.uk/page/modules/infectiousdiseases_pathogens/index.cfm

Preventing the spread of infectious diseases is the subject of:
www.abpischools.org.uk/page/modules/infectiousdiseases_timeline/index.cfm

Modern vaccination in immunity:

www.abpischools.org.uk/page/modules/infectiousdiseases_immunity/index.cfm

Treatment of bacterial infection through the use of antibiotics:

www.abpischools.org.uk/page/modules/infectiousdiseases_medicines/index.cfm

Common infectious diseases:

www.abpischools.org.uk/page/modules/diseases/diseasesl.cfm

Publisher NHS – National Health Service – (2010). Pg 28. £ 3.99.

http://www.library.nhs.uk/guidelinesFinder/SearchResults.aspx?searchText=mrs%20A%20visit%20the%20hospital&tabID=288

E’ in particolare l’aspergillo che causa l’aspergillosi a coinvolgere i pazienti immuno-compromessi, i pazienti con trapianto di midollo, i pazienti trattati per linfomi e leucemia, i pazienti sottoposti a trapianto di organi, i pazienti sottoposti a chemioterapia. Gli impianti di trattamento dell’aria, condizionamento, ventilazione devono essere tenuti sotto stretto controllo dal punto di vista microbiologico per accertare che i microrganismi veicolati dalla polvere provocata dai lavori non creino problemi in particolare ai pazienti citati. Una regola di massima per accertare la qualità dell’aria all’interno delle strutture è quella di raffrontare metodicamente, ad intervalli regolari, la carica microbica interna con quella esterna mediante il campionatore microbiologico d’aria: quella interna deve sempre essere inferiore a quella dell’ambiente circostante.