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Metodi ufficiali per analisi microbiologica latte e derivati

ISO 707 IDF 50:2008 – Metodi di campionamento del latte e derivati per analisi microbiologiche, chimiche, fisiche, sensoriali

International Standard ISO 707 IDF 50:2008 – Metodi di campionamento del latte e derivati per analisi microbiologiche, chimiche, fisiche, sensoriali
Latte e prodotti lattiero-caseari – Guida per il campionamento ISO 707/IDF 50:2008
Questa ISO fornisce una guida sui metodi per il campionamento dei prodotti lattiero-caseari per le analisi microbiologiche, chimiche, fisiche e sensoriali, non riguarda il campionamento (semi)automatizzato.

- selezione del personale: la persona che deve svolgere il campionamento dovrebbe essere autorizzata, addestrata e priva di malattie contagiose.
- siglare ed etichettare i campioni: i campioni dovrebbero essere siglati ed etichettati riproducendo integralmente l’identificazione del prodotto, la natura e il numero d’integrazione, il nome e la firma della persona autorizzata ad eseguire i campioni.
- repliche dei campioni: i campioni dovrebbero essere prelevati in doppio, o in maggior numero, se questo deriva da una richiesta legale o se è concordato tra le parti interessate.
- report del campionamento: i campioni dovrebbero essere accompagnati da un report, firmato (anche solo con le iniziali) dal personale autorizzato al campionamento e controfirmato da dei testimoni presenti.
- attrezzatura per il campionamento: dovrebbe essere di acciaio inossidabile o un altro materiale idoneo, il quale non deve causare cambiamenti nel campione da analizzare. Il materiale da utilizzare per le analisi microbiologiche dovrebbe essere pulito e sterilizzato prima dell’uso. Per le analisi chimiche-fisiche e sensoriali il materiale per il campionamento dovrebbe essere pulito e asciutto al fine di non influenzare proprietà come l’odore, il flavour, la consistenza e la composizione del campione da analizzare.
- contenitori per il campione: dovrebbero essere di un materiale adeguato a proteggere il campione e non dovrebbero causare cambiamenti nel campione. I materiali più appropriati sono il vetro, alcuni materiali metallici (es. acciaio inossidabile) e alcune plastiche (es polipropilene). I contenitori dovrebbero essere preferibilmente opachi.
- campionamento: dovrebbe essere il più rappresentativo possibile del campione da analizzare. Se i campioni per il laboratorio vengono presi separatamente per le analisi microbiologiche, chimico-fisiche e sensoriali, quelli destinati alle analisi microbiologiche devono essere eseguiti in condizioni asettiche e usando contenitori ed attrezzature sterili.
- immagazzinamento e trasporto dei campioni: l’immagazzinamento e la spedizione dei campioni dovrebbe avvenire in maniera tale che il campione arrivi inalterato al momento dell’inizio dell’analisi. Durante il trasporto, dove è necessario, dovrebbero essere prese delle precauzioni al fine di impedire l’esposizione ai cattivi odori, alla luce del sole diretta e ad altre condizioni avverse. Se è necessaria mantenere i campioni ad una temperatura refrigerata, il range di temperatura deve andare incontro alle richieste legali o a quelle di produzione. La temperatura di immagazzinamento, dopo campionamento, dovrebbe essere raggiunta il più rapidamente possibile. Dopo il campionamento i campioni dovrebbero essere immediatamente invitati al laboratorio d’analisi, preferibilmente entro 24 ore. Dovrebbero essere inviati secondo le istruzioni del laboratorio d’analisi. Dopo il prelievo dell’aliquota del campione da analizzare, l’analisi dovrebbe essere fatta immediatamente.

Questa ISO viene applicata a:
- Latte e prodotti liquidi a base di latte
- Latte concentrato non zuccherato, latte condensato zuccherato e concentrato di latte
- Prodotti lattiro-caseari semi-solidi e solidi, tranne il burro e il formaggio
- Il ghiaccio edibile, i ghiacci semi-lavorati e altri prodotti lattiero-caseari congelati
- Latte e prodotti lattiero-caseari in polvere
- Burro e relativi prodotti
- Grassi che derivano dal burro e relativi prodotti
- Formaggio

ISO 6611/IDF 94:2004 – Conta delle unità formanti colonia (UFC) di lieviti e/o muffe – Conta a 25 gradi C

- Preparare le piastre usando un terreno specifico [Yeast extract-glucose-chloramphenicol-agar medium (YGC agar)] e preparare la prima diluizione e le diluizioni decimali successive del campione.
- Incubare le piastre in condizioni di aerobiosi a 25°C per 5 giorni.
- Calcolare il numero di microrganismi per millilitro di campione in base al numero di colonie per piastra e in base alla diluizione di riferimento.

Terreno: estratto di lievito (5,0g); glucosio (20,0g); cloranfenicolo* (0,1g); agar 12-15g; acqua (1000ml).
*allo scopo di avere una concentrazione finale nel terreno pari a 100 µg/ml.

ISO 7251 – ISO 16649 – ISO Enumeration of presumptive Escherichia coli in latte e derivati

Part 1: MOST PROBABLE NUMBER TECHNIQUE ISO 7251 (2005)
Part 2: MOST PROBABLE NUMBER TECHNIQUE USING 4-METHYLUMBELLIFERYL – ß – D – GLUCURONIDE (MUG) ISO 16649-1 (2001)
Part 3: COLONY –COUNT TECHNIQUE AT 44°C USING MEMBRANES ISO 11866-2 (2005)

Preparare il campione secondo quanto previsto dall’ International Standard ISO 4831..

Parte 1:
- Inoculo di tre provette di brodo selettivo (Lauryl sulphate tryptose broth).
- Incubare le provette a 37°C ± 1°C per 24-48h. Controllare le provette per monitorare la produzione di gas.
- Da ogni provetta in cui c’è stata produzione di gas, fare un passaggio in brodo in una provetta con EC brodo.
- Incubare a 44°C ± 1°C per 24h ± 3h. Controllare la produzione di gas nelle provette di EC.
- Da ogni provetta di EC in cui c’è stata produzione di gas fare un passaggio in brodo in acqua peptonata, la quale va controllata per la formazione di indolo.
- Determinazione del numero più probabile (most probable number -. MPN) di presunti Escherichia coli grazie alle tabelle del MPN. Questo numero viene calcolato in funzione delle provette di Lauryl sulphate tryptose e EC risultate positive alla produzione di gas e a quelle di acqua peptonata risultate positive alla formazione di indolo.

Parte 2:
- Inoculo di tre provette di brodo selettivo (Lauryl sulphate tryptose broth modificato con MUG).
- Incubare le provette a 30°C per 24-48h.
- Identificazione di quelle provette che presentano fluorescenza e formazione di indolo come possibili Escherichia coli.
- Identificazioni delle provette in cui vi è sviluppo di gas come positive per la presenza di coliformi.
- Determinazione del numero più probabile (most probable number -. MPN) di presunti Escherichia coli grazie alle tabelle del MPN.
Parte 3:
- Filtrare una quantità precisa di campione da analizzare su delle membrane di cellulosa-acetato coprendola con glutammato agar, incubare a 37°C per 4h.
- Porre le membrane sulla superficie del terreno agar triptone-bile. Incubare a 44°C per 18-24h.
- Verificare la presenza di Escherichia coli attraverso la prova, su ogni colonia, della produzione di indolo.
- Calcolare ufc/g o mL di Eschericha coli, in base al numero di colonie risultate positive alla prove dell’indolo.

ISO/TS 22964/IDF/RM 210:2006 – Ricerca di Enterobacter sakazakii in latte e derivati

1) Pre-arricchimento in un brodo non selettivo: aggiungere al campione da analizzare buffered peptone water (BPW) e incubare a 37°C ± 1°C per 16h – 20h.
2) Arricchimento in un terreno selettivo: il terreno selettivo [modified lauryl sulphate tryptose broth (mLST)/vancomycin medium] deve essere inoculato con la coltura ottenuta dopo pre-arricchimento, poi incubato a 44°C ± 0,5°C per 22h ± 26h.

3) Preparazione delle piastre ed identificazione: inoculare un terreno cromogeno agarizzato con la coltura “arricchita” e incubare a 44°C ± 1°C per 22h ± 26h.

4) Conferma: le colonie tipiche devono essere selezionate dal terreno cromogeno, quelle che producono un pigmento giallo su tryptone soya agar (TSA) devono essere caratterizzate bio-chimicamente.

*Le colonie tipiche sono di dimensioni piccole/medie di colore verde/blu-verde. Le colonie non tipiche sono spesso leggermente trasparenti e colorate di viola.

ISO 6730/IDF 101:2005 – Conta UFC dei microrganismi psicrotrofi – Conta a 6,5 °C.

- Preparare le piastre usando un terreno specifico e preparare la prima diluizione e le diluizioni decimali successive del campione.
- Incubare in condizioni di aerobiosi a 6,5°C ± 0,5°C per 10 giorni.
- Calcolare il numero di unità formanti colonia (UFC) di microrganismi per millilitro di campione in base al numero di colonie per piastra e in base alla diluizione di riferimento.

Terreno: tryptone (5,0g); estratto di lievito (2,5g); glucose monohydrate (1,0g); latte in polvere magro (senza sostanze inibenti) (1,0g); agar 10-15g; acqua (1000ml).

ISO 8552/IDF 132:2004 -Stima dei microrganismi psicrotrofi. Conta a 21°C (metodo rapido)

Latte
Stima dei microrganismi psicrotrofi – Conta a 21 °C (metodo rapido)
ISO 8552/IDF 132:2004
- Preparare le piastre usando un terreno specifico e preparare la prima diluizione e le diluizioni decimali successive del campione.
- Incubare le piastre in condizioni di aerobiosi a 21°C per 25h.
- Calcolare il numero di microrganismi per millilitro di campione in base al numero di colonie per piastra e in base alla diluizione di riferimento. Terreno: estratto di lievito (2,5g); enzymatic digestion of casein (5,0g); latte in polvere magro (senza sostanze inibenti) (1,0g);glucose anidro (1,0g); agar 9-18g; acqua (1000ml).

ISO 4831 – ISO 4832 – Conta dei coliformi

- ISO 4831:2006 -MOST PROBABLE NUMBER TECHNIQUE AT 30°C

Preparare il campione secondo quanto previsto dall’ International Standard ISO 4831:2006

- Inoculare il campione e/o le diluizioni del campione in triplo in provette contenenti il terreno selettivo e le campanelle di Durham.
- Incubare le provette a 30°C per 48h.
- Inoculare eosin-methylene blue agar con il contenuto delle “presunte” provette positive, per es. le provette contenenti bile brilliant green broth, in cui si è evidenziata produzione di gas.
- Incubare le provette a 30°C per 24h.
- Dalle provette in cui c’è stata conferma di positività, per es quelle in cui si è evidenziata la produzione di gas e crescita caratteristica in eosin-methylene blue agar, calcolare il numero di coliformi per millilitro o per grammo di campione (usando le tabelle MPN).

- ISO 4832:2006 – COLONY COUNT TECHNIQUE AT 30°C ISO 4832:2006

- Mettere in una piastra Petri un’aliquota del campione o le sue diluizioni decimali e il terreno agarizzato opportuno (es VRBL).
- Incubare a 30°C per 24h.
- Contare le colonie caratteristiche e, se necessario, confermarle attraverso il test della fermentazione del lattosio, vi è una produzione di gas
- Calcolare il numero di coliformi per millilitro o per grammo di campione.

ISO 20128 – IDF 192:2006 – Conta di Lactobacillus acidophilus mediante metodo selettivo
Conta di Lactobacillus acidophilus attraverso metodo selettivo – Tecnica della conta delle colonie a 37°C ISO 20128:2006/ IDF 192:2006

- Pesare una quantità nota di campione, aggiungere il diluente e preparare le opportune diluizioni decimali.
- Le diluizioni scelte devono essere spatolate su piastre di MRS-clindamicina agar (MRS agar con l’aggiunta di 0,1 mg di clindamicina per litro di terreno).
- Incubare le piastre in anaerobiosi a 37°C per 72h ± 3h.
- Contare le colonie tipiche ed esprimere il risultato in riferimento alle diluizioni prese i considerazione.

ISO 13559 – IDF 153:2002 – Conta dei microrganismi contaminanti

Burro, latte fermentati e formaggi freschi
Conta dei microrganismi contaminanti – Conta a 30°C
ISO 13559/IDF 153:2002
- Preparare le piastre usando lo specifico terreno e spatolare 0,1 mL della diluizione iniziale. Preparare le altre piastre nelle medesime condizioni e spatolare 0,1mL delle diluizioni successive.
- Mettere ad incubare le piastre a 30°C ± 1°C per 72h.
- Dal numero di colonie contate calcolare il numero di microrganismi per grammo di campione.

Terreno: peptone di caseina (7,5g); peptone di gelatina (7,5g); NaCl (5,0g); agar (10-15g); acqua (1000mL).

ISO 8553/IDF 131:2004 -Metodo per il conteggio dei microrganismi con la tecnica dello striscio su piastra “plate loop” a 30°C in latte crudo

Prendere il campione da analizzare con un’ansa metallica di dimensioni ben definite, aggiungere il terreno in una piastra Petri e incubare a 30°C per 72h. Contare le colonie e calcolare il numero di microrganismi per millilitro di campione
Terreno: Estratto di lievito (2,5g); Triptone (5,0g);Glucosio monoidrato (1,0g); Latte magro in polvere (1,0g); Agar (10-15g); Acqua (1000mL).

FIL-IDF 170A:1999 – Numerazione presuntiva di Escherichia coli – Enumeration of presumptive Escherichia coli
Part 1: MOST PROBABLE NUMBER TECHNIQUE
Part 2: MOST PROBABLE NUMBER TECHNIQUE USING 4-METHYLUMBELLIFERYL – ß – D – GLUCURONIDE (MUG)
Part 3: COLONY –COUNT TECHNIQUE AT 44°C USING MEMBRANES

Preparare il campione secondo quanto previsto dall’ International Standard

Parte 2:
- Inoculo di tre provette di brodo selettivo (Lauryl sulphate tryptose broth modificato con MUG).
- Incubare le provette a 30°C per 24-48h.
- Identificazione di quelle provette che presentano fluorescenza e formazione di indolo come possibili Escherichia coli.
- Identificazioni delle provette in cui vi è sviluppo di gas come positive per la presenza di coliformi.
- Determinazione del numero più probabile (most probable number -. MPN) di presunti Escherichia coli grazie alle tabelle del MPN.
Parte 3:
- Filtrare una quantità precisa di campione da analizzare su delle membrane di cellulosa-acetato coprendola con glutammato agar, incubare a 37°C per 4h.
- Porre le membrane sulla superficie del terreno agar triptone-bile. Incubare a 44°C per 18-24h.
- Verificare la presenza di Escherichia coli attraverso la prova, su ogni colonia, della produzione di indolo.
- Calcolare ufc/g o mL di Eschericha coli, in base al numero di colonie risultate positive alla prove dell’indolo.

ISO 6785 / IDF 093:2001 – Ricerca di Salmonella –

Protocollo
La ricerca di Salmonella necessita di quattro stadi successivi:

1) Pre-arricchimento in un brodo non selettivo: 25 g o mL di campione in 225 mL di pre-arricchimento (Acqua peptonata) (37°C ± 1 per 16-20 h)
2) Arricchimento in due brodi selettivi:
- 0,1 mL della coltura in 10 mL di Rappaport–Vassiliadis (RV) (41°C ± 1 in un bagnetto per 24 h e per altre 24 h)
- 10 mL della coltura in 100 mL di Selenite Cistina (SC) (37°C ± 1 per 24 h e per altre 24 h)
3) Striscio ed identificazione:
- primo striscio delle colture ottenute da RV e SC su Xylosio Lysine Desoxycholate (e su un altro terreno a scelta) (37°C ± 1 per 20-24 h e altre 18-24 h se necessario)
- dopo incubazione di RV e SC per altre 18-24 h secondo striscio delle colture ottenute su Xylosio Lysine Desoxycholate (XLD) agar (e su un altro terreno a scelta) (37°C ± 1 per 20-24 h e altre 18-24 h se necessario)
4) Conferma: Test biochimici e sierologici di conferma.

ISO 11290-1/IDF 143A:2004 – Detection of Listeria monocytogenes

La ricerca di Listeria monocytogenes necessita di tre stadi successivi

1) Arricchimento in un brodo selettivo: 25 g o mL di campione in 225 mL di arricchimento selettivo (Half Fraser) (30°C ± 1 per 48 ± 2 h)
2) Isolamento ed identificazione:
- 0,1 mL della coltura in 10 mL di Fraser (37°C ± 1 per 48 h)
- Striscio su ALOA e (PALCAM) agar (37°C ± 1 per 48 h)
3) Conferma: test morfologici, fisiologici e biochimici per conferma.
ISO 21871 (2006) – Metodo orizzontale per la ricerca di Bacillus cereus – Tecnica del Most Probable Number e metodo di riconoscimento

Preparare il campione secondo quanto previsto dall’ International Standard.

1) Arricchimento in brodo selettivo: inoculare tre provette contenenti il brodo selettivo, Tryptone soya polymyxin broth (TSPB), con una certa quantità della prima diluizione e delle successive (tecnica del MPN). Preparare un numero sufficiente di diluizione in modo tale che le provette corrispondenti alla diluizione finale diano un risultato negativo. Incubare a 30°C per 48h ± 4h.
Nel caso si volesse fare la conta solamente delle spore del Bacillus cereus sottopporre la prima diluizione ad un trattamento termico pari a 80°C per 10 min.

2) Riconoscimento: da ogni provetta prelevare un’ansa di coltura e strisciarla su polymyxin pyruvate egg yolk mannitol bromothymol blue agar (PEMBA) o su mannitol egg yolk polymyxin agar (MYP). Incubare a 37°C (PEMBA) o 30°C (MYP) per 18h-24h. se le colonie non dovessero essere nitide incubare le piastre per altre 24h.

3) Conferma: conferma mediante test biochimici (fermentazione del glucosio, Voges-Proskauer test e riduzione dei nitrati) e attraverso l’uso del microscopio.

4) Calcolo ed espressione dei risultati: per ogni diluizione di TSPB registrare il numero delle provette in cui la presenza di Bacillus cereus è stata confermata dai test di conferma. Da tre diluizioni consecutive si ottiene l’indice MPN (ISO 7218:2007). Il numero più probabile di Bacillus cereus per grammo si ottiene moltiplicando l’indice di MPN per la diluizione scelta più bassa.

O157 – ISO 16654 (2001) – Metodo orizzontale per la ricerca di Escherichia coli

Protocollo
Preparare il campione secondo quanto previsto dall’ International Standard
1) Arricchimento del campione omogeneizzato da analizzare in triptone soya broth con novobiocina (mTSB + N). Incubazione a 37°C ± 1°C per 6h e poi a 41,5 °C ± 1°C per successive 18-24h.
2) Concentrazione e separazione di E.coli O157 mediante biglie immunomagnetiche e lavaggio con buffer sterile.
3) Risospensione in 0,1 mL di buffer sterile
4) Inoculare 50 µL delle biglie lavate e risospese in un terreno selettivo per ottenere le colonie isolate: si utilizza il Tellurite cefixime sorbitol MacConkey agar (TC-SMAC) e a scelta un secondo terreno selettivo (incubazione a 37°C ± 1°C per 18-24h)
5) Prendere 5 colonie sorbitolo negative
6) Conferma mediante test biochimici.

ISO 10272 – 1 (2006) – Metodo orizzontale per la ricerca di Campylobacter spp. – Metodo di ricerca

Preparare il campione secondo quanto previsto dall’ International Standard.
La ricerca del Campylobacter spp. prevede i seguenti passaggi.
1) Arricchimento in brodo selettivo: inoculare 25 mL o g di campione da analizzare con 225 mL di Bolton ed omogeneizzare. Incubazione in microaerofilia a 37°C per 4-6h e poi a 41,5°C per 44h ± 4h.
2) Isolamento e selezione per la conferma: inoculo delle colture in:
- mCCD agar (modified charcoal cefoperazone deoxycholate);
- un altro terreno agar selettivo basato su un principio diverso dal mCCD agar.
Incubazione a 41,5°C in microaerofilia per 44h ± 4h, dopodichè controllare se ci sono delle colonie che potrebbero essere Campylobacter spp.
3) Conferma: conferma attraverso l’uso del microscopio e mediante test biochimici e di crescita (motilità, test dell’ossidasi ecc.).

ISO 6888-1 / IDF 145:1999 – Conta di stafilococchi coagulasi positivi (Baird Parker Agar Medium)
Conta di Stafilococchi coagulasi positive (Staphylococcus aureus e altre specie) (Baird-Parker agar medium)

Protocollo
Preparare il campione secondo quanto previsto dall’ International Standard

1) Inoculo:
inoculare 0,1 mL del campione da analizzare in piastre di Baird-Parker agar. Ripetere la procedura, se necessario, per le diluizioni successive.

2) Incubazione:
incubare le piastre per 24h ± 2h e per altre 24h ± 2h a 37 °C

3) Lettura ed interpretazione delle piastre:
dopo 24h ± 2h fare una prima lettura delle piastre. Incubarle a 37°C per altre 24h ± 2h e rileggere le piaste. Considerare solo le piastre che presentano un massimo di 300 colonie con almeno 150 colonie tipiche o atipiche. Per la conferma scegliere 5 colonie tipiche. NOTA: le colonie tipiche sono nere o grigie, brillanti, convesse e circondate da un alone di chiarificazione.

4) Conferma (test della coagulasi):
prelevare la colonia e metterla in una provetta di brain-heart infusion brodo. Incubare a 37° C per 24h ± 2h. Sterilmente aggiungere 0,1 mL della coltura a 0,3 mL di plasma citrato di coniglio e incubare a 37° C. Controllare la coagulazione dopo 4-6h.
ISO 6888-2 IDF 145:1999 – Conta di stafilococchi coagulasi positivi (Staphylococcus aureus e altre specie) con Rabbit Plasma Fibrinogen Agar Medium)

Protocollo
Preparare il campione secondo quanto previsto dall’ International Standard

1) Inoculo:
inoculare 1 mL del campione da analizzare in una piastra Petri sterile. In ogni piastra Petri mettere del Rabbit plasma fibrinogen agar medium, in modo tale da formare uno spessore di circa 3 mm.

2) Incubazione:
dopo completa solidificazione incubare le piastre a 37 °C per 18-24h, se necessario per altre 18-24h.

3) Conta delle colonie:
contare le colonie tipiche in ogni piastra. Le colonie che risultano coagulasi positive sono nere o grigie o bianche e sono circondate da un alone di precipitazione. NOTA: con il rabbit plasma fibrinogen agar non è necessario nessun test di conferma.

ISO/WD 13720 (1999) – Horizontal method for the enumeration of Pseudomonas spp – Metodo orizzontale per la conta di Pseudomonas spp.

Microbiologia degli alimenti e degli alimenti per animali
- Inoculare la superficie del terreno selettivo con un’aliquota del campione da analizzare se quest’ultimo è liquido, o con un’aliquota della diluizione iniziale nel caso di altri campioni. Preparare le altre piastre nelle medesime condizioni.
- Mettere ad incubare le piastre in aerobiosi a 25°C per 48h.
- Dal numero di colonie contate calcolare il numero di microrganismi per grammo di campione. Confermare le colonie attraverso il test dell’ossidasi e la crescita in glucosio agar.

Terreno: Cetrimide, fucidin and cephaloridine (CFC) agar
Terreno base: enzymatic digest of gelatine (16,0g); enzymatic digest of casein (10,0g); potassium sulphate (K2SO4) (10,0g); magnesium chloride (MgCl2) (1,4g); agar (12-18g); water (1000mL).

Terreno finale	Volume	Final conc.
Basic medium	100 ml
Cetrimide solution	1 ml	10µg/ml
Fucidin solution	1 ml	10µg/ml
Cephaloridine solution	1 ml	10µg/ml

ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 – Conta presunta di bifido-batteri a 37°C

1) Inoculare le opportune diluizioni decimali del campione in piastre contenenti TOS-agar con l’aggiunta di MUP; incubare in condizioni di anaerobiosi a 37°C per 72 h.

2) Contare le colonie

3) Il numero di bifidobatteri per grammo di campione viene calcolato dal numero di colonie moltiplicato per la diluizione corrispondente

* L’antibiotico Li-Mupirocin (MUP) inibisce la crescita della maggior parte dei batteri lattici comunemente usati nei prodotti lattiero-caseari fermentati e non.

ISO/TS 27265 – Latte in polvere. Metodo per la enumerazione delle spore termoresistenti dei batteri termofili.

Le spore di Clostridium butyricum e Clostridium sporogenes (meno frequente nel latte il Clostridium tyrobutiricum) sono quelle che producono il gonfiore nel formaggio.

La germinazione delle spore presenti nel latte da caseificare e la successiva attività metabolica delle forme vegetative determina una notevole produzione di anidride carbonica, di idrogeno e acidi volatili (in genere acido butirrico e acido acetico). La produzione di gas è responsabile del gonfiore, delle occhiature e delle spaccature della pasta del formaggio. La produzione di acidi organici e l’attività proteolitica portano ad alterazioni di sapore ed aroma del formaggio.

-La determinazione delle spore

La determinazione dei clostridi nel latte è un problema non ancora completamente risolto.

Il metodo ancora oggi usato è quello del Most Probable Number (MPN) che prevede la pastorizzazione del campione in modo da eliminare tutte le specie batteriche non sporigene, e le forme vegetative degli stessi sporigeni.

Il campione viene inoculato in provette che contengono il terreno nutritivo: in genere sono effettuate tre diluzioni per 3 o 5 ripetizioni. Le condizioni anaerobiche si ottengono con la formazione di un tappo sulla superficie delle provette inoculate, costituito da una miscela di vaselina e paraffina. L’eventuale spostamento del tappo verso l’alto della provetta, in seguito alla formazione di gas, all’interno del terreno sottostante, dovuto alla germinazione delle spore ed allo sviluppo dei clostridi anaerobi gasogeni, rappresenta il sistema mediante il quale si determina il risultato analitico. Dalla positività delle provette inseminate per ciascun campione, applicando tavole numeriche statistiche si determina il numero più probabile di spore presenti nel campione.

Il risultato si ottiene in 3-5 giorni.