Il metodo microscopico per la enumerazione delle cellule somatiche nel latte
Il metodo microscopico è quello indicato nella Norma FIL-IDF 148A:1995 Metodo A qui riportato che richiama la Decisione della Commissione 91/180/CEE 14 Febbraio 1991 che stabilisce metodi di analisi e di prova relativi al latte crudo ed al latte trattato termicamente:
91/180/CEE: Decisione della Commissione, del 14 febbraio 1991, che stabilisce metodi di analisi e di prova relativi al latte crudo e al latte trattato termicamente.
(NORMA FIL/IDF 148A:1995 Metodo A):
VII. ENUMERAZIONE DELLE CELLULE SOMATICHE
Il presente procedimento descrive due metodi come metodi di riferimento per la numerazione delle cellule somatiche:
A. Il metodo microscopico (Fil IDF 148A:1995)
B. Il metodo fluoro-opto-elettronico.
A. Metodo Microscopico
1. Oggetto e campo di applicazione
Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento per la enumerazione delle cellule somatiche nel latte crudo.
Il presente procedimento descrive il metodo per la determinazione del numero di cellule nel campione di latte per tarare e verificare l’accuratezza del metodo fluoro-opto-elettronico (vedi B.1).
2. Definizione
Ai fini del presente metodo per cellule somatiche si intendono quelle cellule, quali leucociti e cellule epiteliali, i cui nuclei possono essere distintamente colorati con il blu di metilene.
3. Principio
0,01 ml di latte vengono distribuiti su un’area di 1 cm$ di vetrino. Il film viene quindi essiccato e colorato. Per il conteggio si usa un microscopio. Il numero di cellule contenute in 1 ml si ottiene moltiplicando il numero di cellule somatiche contate in un’area determinata per il fattore di lavoro.
4. Reattivi
Le sostanze usate devono essere di purezza analitica.
Soluzione colorante
Composizione
Blu di metilene
0,6 g
Etanolo – 99 %
54,6 ml
1,1,1-tricloroetano oppure tetracloroetano
40,6 ml
Acido acetico glaciale
6,6 ml
Avvertenza
Il tetracloroetano è velenoso. Nel caso venga usato, la preparazione del colorante e l’applicazione sul vetrino devono essere effettuate sotto cappa.
Preparazione
Mescolare l’etanolo con l’1,1,1,-tricloroetano o il tetracloroetano in una bottiglia e riscaldare a bagnomaria a 60-70 gC. Addizionare il blu di metilene, mescolare accuratamente, raffreddare in frigorifero a 4 gC per 12-24 ore ed aggiungere acido acetico glaciale. Filtrare su filtro con diametro dei pori non superiore ai 10-12 micron e conservare la soluzione colorante in una bottiglia a tenuta d’aria. Se si sono formati granelli o sedimenti, prima dell’uso filtrare nuovamente.
5. Apparecchiatura e vetreria
5.1. Microscopio con ingrandimento di 500-1 000.
5.2. Microsiringa 0,01 ml con precisione non inferiore a p 2 %.
5.3. Vetrino con campo delimitato di 20 mm × 5 mm per il film, oppure un vetrino standard ed una sagoma di 20 mm × 5 mm delimitante il campo per il film.
5.4. Piastra riscaldante livellata (30-50 gC) per essiccare i vetrini.
5.5. Phon (asciugacapelli) per asciugare il film.
5.6. Bagnomaria, termostatabile a 30-40 gC per riscaldare il campione di latte.
5.7. Vetrino micrometrico di riferimento, con intervalli di 0,01 mm.
6. Procedimento
6.1. Campione di latte
Il campione di latte deve essere analizzato entro 6 ore dal campionamento. La temperatura di conservazione non deve superare i 6 gC. Occorre evitare il congelamento.
6.2. Preparazione del campione nel laboratorio
Riscaldare il campione in bagnomaria (5.6) a 30-40 gC. Mescolare quindi con cura. Raffreddare alla temperatura alla quale è stata tarata la microsiringa (5.2), ad esempio 20 gC.
6.3. Pre-trattamento dei vetrini
Pulire i vetrini (5.3), ad esempio con etanolo, asciugare con carta che non lasci particelle, esporre alla fiamma e raffreddare. Conservare in una scatola per evitare la polvere.
6.4. Preparazione del film
Prelevare con una microsiringa (5.2) 0,01 ml di latte dal campione preparato come descritto. Pulire accuratamente la parte esterna della siringa che viene a contatto con il latte. Portare la siringa sul vetrino (5.3) seguendo dapprima il contorno del rettangolo (20 mm × 5 mm) e ricoprendo quindi tutta la superficie il più uniformemente possibile. Porre il vetrino su una piastra riscaldante livellata (5.4) fino a essiccazione completa.
Per ciascun campione di latte devono essere preparati ed analizzati almeno due film.
6.5. Colorazione dei film
Immergere nella soluzione colorante (4) per 10 minuti. Essiccare, completando eventualmente con il phon (5.5). Immergere i film in acqua di rubinetto fino ad asportare tutto il colore in eccesso. Essiccare quindi nuovamente e conservare al riparo dalla polvere.
6.6. Taratura del campo microscopico
Sulla base dell’ingrandimento scelto (× 500 – × 1 000) determinare il diametro del campo microscopico con il vetrino micrometrico di riferimento (5.7).
7. Conteggio e calcolo
7.1. Conta delle cellule
Con il microscopio (5.1). Contare anziché le cellule soltanto i loro nuclei. Questi sono chiaramente riconoscibili e per la conta almeno la metà del nucleo deve essere visibile nel campo microscopico. Contare le strisce o i campi nel terzo centrale del film, evitando di prendere in considerazione quelli che ricadono esclusivamente nelle zone periferiche del film. L’accuratezza con cui sono stati preparati i film e quindi l’attendibilità dei risultati, deve essere controllata almeno una volta al mese eseguendo la conta in varie parti del film. Il conteggio può essere anche effettuato contando i campi microscopici ripartiti in modo tale che tutte le parti del film siano ugualmente rappresentate.
7.2. Numero minimo di cellule da contare
Poiché la conta delle cellule somatiche al microscopio può essere anche usata per la standardizzazione dei procedimenti di conteggio automatico e meccanizzato, il coefficiente di variazione delle conte su campioni identici non deve risultare più elevato di quello ottenuto con strumenti elettronici. Il coefficiente di variazione per un campione di latte contenente 400 000-600 000 cellule/ml non deve superare il 5 %.
Per ottenere questo valore di ripetibilità il numero di cellule somatiche da contare per ciascun campione deve essere, in base alle caratteristiche della distribuzione di Poisson, di almeno 400.
La distribuzione di Poisson presuppone
M = V = s$,
dove
M è il valore medio,
V
è la varianza
e
s
è la deviazione standard.
Il coefficiente di variazione è:
CV = s × 100 % oppure CV = 100 % oppure CV = 100 %
CV =
s × 100 %
M
oppure CV =
100 %
s
oppure CV =
100 %
wM-
dove M (media) indica il numero di particelle (cellule) che sono state contate (cioè 400 per CV = 5 %).
7.3. Calcolo del fattore di lavoro
Nel caso di 0,01 ml di latte il fattore di lavoro è calcolato secondo 7.3.1 o 7.3.2.
7.3.1 Conteggio delle strisce tracciate trasversalmente al film
La lunghezza di ciascuna striscia su cui effettuare la conta è di 5 mm mentre la larghezza corrisponde al diametro del campo microscopico delimitato dal vetrino micrometrico di riferimento (5.7).
Fattore di lavoro = 20× 100
Fattore di lavoro =
20 × 100
d × b
dove
d = è il diametro del campo microscopico in mm, delimitato dal vetrino micrometrico di riferimento (5.7),
b
= è il numero di strisce su cui la conta è stata effettuata per intero.
7.3.2. Effettuando la conta dei campi microscopici nel terzo centrale del film oppure mediante la griglia
Fattore di lavoro: 20 × 5 × 100 = 12 732
Fattore di lavoro:
20 × 5 × 100
P × d² × s
4
=
12 732
d² × s
dove
d = è il diametro del campo microscopico in mm delimitato dal vetrino micrometrico di riferimento (5.7),
s
= è il numero di campi in cui è stata effettuata la conta.
7.4. Calcolo del tenore in cellule
Si moltiplica il numero di cellule somatiche contate (7.1 e 7.2) per il fattore di lavoro (7.3), ottenendo il numero di cellule per ml di latte.
7.5. Precisione
Il coefficiente di variazione (vedi 7.2) non deve essere superiore al 5 %.
Per la precisione non sono disponibili risultati di prove interlaboratorio accettate a livello internazionale
